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为什么ELISA实验需充分室温平衡
2025-11-02
1. 保证酶促反应的稳定性与一致性
ELISA实验的最后一步是加入底物液（TMB等），通过酶（通常是HRP-辣根过氧化物酶）催化底物发生颜色反应。酶促反应的速率高度依赖于温度。
如果试剂（特别是酶结合物和底物）直接从4℃冰箱取出就使用，它们的温度很低。在低温下，酶的活性很低，催化反应速度慢。
如果将低温的试剂加入已在37℃孵育好的板孔中，会瞬间导致孔内温度下降，使得酶促反应无法在预设的、稳定的温度下进行。
结果就是：各孔之间的反应速率不一致，有的孔温度高反应快，有的孔温度低反应慢。这会导致显色不均匀，最终测得的OD值波动很大，重复性差，数据不可信。
2. 避免微孔板孔内形成冷凝水
这是一个非常实际的问题。
如果冷冻的酶标板（板条）从密封袋中取出后，立即在室温下打开，特别是环境湿度较高时，冷的板条表面会迅速凝结空气中的水蒸气，形成微小的液滴（冷凝水）。
危害：这些冷凝水会滴入或残存在孔中，稀释了孔内已经包被好的抗原、捕获抗体或后续加入的样品和试剂，直接改变了反应体系的浓度，导致实验结果严重偏差（通常是假阴性或信号值偏低）。
3. 确保液体加样的准确性
液体的粘度受温度影响。低温下的液体粘度稍高。
如果试剂和样品没有平衡到室温，在用多通道移液器或单通道移液器加样时，粘度的差异可能导致每孔加入的体积有微小但关键的差异。
尤其是在使用排枪进行快速加样时，室温平衡的液体能保证每次吸取和排出的体积更加精确和一致。
4. 使抗原抗体反应达到最佳状态
虽然ELISA的孵育通常在37℃的孵育箱中进行，但反应的第一步——抗原与抗体的结合——从加入样品的那一刻就开始了。如果冰冷的样品被加入到预温的板孔中，结合反应在初始阶段会因温度不均而效率低下，影响最终结合的抗原抗体复合物总量。
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