常用方法及原理

夹心法
夹心法常用于检测大分子抗原,一般的操作步为:
a.将具有一性的抗体固著(coating)于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
b.加入待测检体,检体中若含有待测的抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行一性键结
c.洗去多余待测检体,加入另一种对抗原一的一次抗体,与待测抗原进行键结
d.洗去多余未键结一次抗体,加入带有酶的二次抗体,与一次抗体键结
e.洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果原理:针对抗原分子上2个不同抗原决定能的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物

间接法
间接法常用于检测抗体,一般的操作步骤为:
a.将已知的抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余的抗原。
b.加入待测检体,检体中若含有待测的一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行一性键结。
c.洗去多余待测检体,加入带有酶的二次抗体,与待测的一次抗体键结。
d.洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酶呈色,藉仪器(ELSAreader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
原理:利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。

竞争法
竞争法一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:
a.将具有一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
b.加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行一性键结
c.加入带有酶的抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行一性键结,由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。
d.洗去检体与带有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少,显色也就越浅。
e.当需要俠测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA.

样品收集、处理及保存方法
1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃,使用室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用充分摇匀。

免责声明
1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。